Méthode de détection rapide de Brettanomyces par PCR quantitative en temps réel

Philippe Humbert

 

La PCR (Polymerase reaction chain) est une méthode qui nait en 1983 aux Etats Unis  pour l’étude du génome. Depuis, cette méthode s’est largement répandue dans d’autres domaines comme le judiciaire avec le développement des tests ADN, mais aussi en microbiologie pour l’identification de micro organismes et leur quantification.

 

Cette méthode trouve une application directe en œnologie car elle détecte, spécifiquement et en temps réel, des levures de contamination appelées Brettanomyces Bruxellensis,  qui  sont responsables de la formation de phénols volatils (odeurs animales, giboyeuses, sueur de cheval, etc.).

Ces phénols volatils sont des déviations aromatiques irrémédiables pour un vin c’est pourquoi il est impératif de contrôler les populations de Brettanomyces qui pourrait s’y être développées.

La PCR quantitative est l’outil le mieux adapté pour cela car en connaissant la charge en Brettanomyces d’un vin on peut limiter leur développement par des traitements appropriés.

De plus, la surveillance ainsi mise en place induira immanquablement, un changement d’habitudes et de pratiques tout au long de l’élaboration des vins.

 
Les points clés de cette méthode pour un usage œnologique sont :

                                - Rapidité : quantification de la charge en Brettanomyces d’un échantillon en 3heures.

                    - Spécificité : détection de l’ADN de Brettanomyces, sans interférence possible avec un autre ADN             microbien.

                   - Sensibilité : à partir de 10 cellules par ml  de vin testé.

 

L’ADN 

 
Le support ou la matière première  de cette méthode est une molécule spécifique, l’ADN ou Acide DésoxyriboNucléique : la molécule de la vie, qui se  présente  spatialement sous la forme de deux brins enroulés en double hélice, chaque brin étant constitué par des nucléotides : les briques élémentaires.

 

 

L’ADN, découvert par James Watson & Francis Crick en 1953 (Prix Nobel en 1962) est retrouvé dans les chromosomes de toutes les cellules vivantes. Il renferme l'ensemble des informations nécessaires au développement et au fonctionnement d'un organisme et porte l'information génétique, constituant le génome des êtres vivants. Il est  donc spécifique de chaque espèce vivante.

 

La PCR comment ça marche ?

 
La méthode consiste à récupérer les Brettanomyces présentes dans le vin par centrifugation et d’en extraire leur ADN.

Une  fois cet ADN récupéré, il sera dénaturé à la chaleur ce qui provoquera l’ouverture de la double hélice et la séparation des deux brins. C’est l’étape de Dénaturation qui se réalise à 94°C

Ces deux brins  séparés sont mis  en présence de nucléotides, d’amorces de la réaction de PCR et d’une sonde fluorescente qui sous l’effet d’une enzyme spécifique, la Polymérase, aboutira à la reconstitution de l’ADN à partir des 2 brins originaux. C’est la deuxième étape l’Hybridation suivi de la troisième l’Élongation. On obtient ainsi à la fin 2 molécules d’ADN, copies conformes de la molécule d’origine et marquées par une fluorescence

C’est le premier cycle.

Ces opérations seront répétées plusieurs fois et on obtiendra ainsi :

            Au deuxième cycle : 4 molécules d’ADN

            Au troisième cycle : 8 molécules d’ADN

            Au quatrième cycle : 16 molécules d’ADN, etc.

 

 

Après de nombreux cycles, la quantité d’ADN fluorescent est suffisamment importante pour être détectée et quantifiée. L’appareil permet  la détection et la quantification de la fluorescence découlant sur la quantification de la charge en Brettanomyces. En simplifiant, la PCR quantitative consiste à faire des photocopies fluorescentes de l’ADN des Brettanomyces présentes dans le vin analysé.

 

Au laboratoire de Grézillac

 

4 techniciens formés à la PCR réalisent cette analyse.

La première étape consiste à extraire l’ADN des Brettanomyces présentes dans les vins à tester (cela dure environ 30 à 45mn), suit l’étape de préparation de la réaction de PCR (environ 20mn) et enfin l’étape de réaction dans le thermocycleur (environ 1h 30).

Un logiciel d’analyse associé au thermocycleur calcule automatiquement les quantités de brettanomyces dans les vins testés avec un seuil de détection allant jusqu’à 10 cellules par ml de vin testé.

 

Le mode opératoire mis en place est caractérisé par :

                                                                                         -   L’utilisation d’un témoin négatif à chaque série.

                                                                                         -    L’utilisation d’un témoin de charge connue à chaque série.

                                                                                       -  L’utilisation d’un marqueur pour chaque échantillon afin de détecter la présence                                    d'inhibiteurs de la PCR et écarter les faux négatifs (Système de contrôle interne                                         positif = PCR artificielle détectée dans le même tube que la PCR Brettanomyces).